CRISPR/Cas9遺伝子編集技術を用い、EGFP 蛍光マーカー（700 bp）をiPS細胞の遺伝子に挿入しました。図に示すように、エクソンE2の上流と下流にsgRNA、さらにEGFPを含むDonor配列も設計しました。sgRNAとDonorをRNP法でiPS細胞にトランスフェクトし、相同性指向性修復（HDR）経路を介して、エクソンE2配列の後半にEGFP配列を挿入しました。

図１.EGFPノックインスキームの設計

PCRとシークエンスによる同定を行った結果、エクソンE2配列の後にEGFPが挿入されたヘテロ接合体iPS細胞株が得られたことが判明しました。細胞培養後、Gバンド染色体解析（G-banding）を用いて核型検査を行ったところ、染色体数は46本と正常であり、明らかな構造異常はないことが確認されました。免疫蛍光染色により、3つの多能性（幹細胞関連）マーカー遺伝子NANOG、OCT4、SOX2の発現を検出し、陽性シグナルが観察されたことから、遺伝子編集ノックイン細胞は多能性を有することが示されました。

Marker

WT:2430bp; KI:3213bp

注意： プライマー設計方針は、EGFP配列全体と上流・下流ゲノム配列の一部を増幅することにあります。EGFPを挿入しない場合のバンドパターンは2430bpであり、EGFP挿入が成功すると、3213bpのバンドが生成されるはずです。結果、8つの単一クローン（番号1～8）は2430bpと3213bpの両方にバンドがあり、これらのクローンはEGFP挿入に成功しており、ヘテロ接合体クローンであることが示されました。

図2.iPS-EGFP KIアガロースゲル電気泳動による同定結果

KIバンド5'配列

AGGCAGAAACAGAAAAGAATGAAATATTCCGCCGGCAT--TGGAAGCGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCA

KIバンド3'配列

CGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA--AAGACTCTTGGCCTCTCCAGAGACGCCCCTTTCCTCGTCC

注意： KIバンド5'配列は、EGFP挿入断片の5'末端と上流ゲノム配列の一部の配列を表示し、KIバンド3'配列は、EGFP挿入断片の3'末端と下流ゲノム配列の一部で構成されています。KIバンド5'配列とKIバンド3'配列の塩基配列解析の結果、いずれもEGFPと一致し、ピークが重なっていることから、このクローンはEGFP挿入断片のヘテロ接合体クローンであることが証明されました。

図3: iPS-EGFPのKI配列決定結果

図4: iPS-EGFPの核型解析(細胞培養後の細胞に対してG-bandingを用いて染色体解析を行ったところ、染色体数は46本と正常であり、染色体構造にも明らかな異常はないことが判明)

図5:iPS-EGFPの多能性マーカーの免疫蛍光染色(多能性マーカー遺伝子であるNANOG、OCT4、SOX2の3つを検出するために免疫蛍光染色を行ったところ、3つのマーカーすべてで陽性シグナルが検出され、トランスフェクトした細胞が多能性を有することが判明)