Immunity（IF=43）：中国北京大学の夏朋延氏らの研究チームが、オーファン受容体Nur77による非古典的NLRP3インフラマソームの活性化メカニズムを解明

　インフラマソーム（inflammasome）は、細胞が病原体や無菌的な損傷に遭遇した際、一連の炎症関連タンパク質のプロセッシングを制御する巨大なタンパク質複合体です。NLRP3インフラマソームは広範に発現し、多様な刺激によって活性化されることが報告されています。NLRP3インフラマソームの活性化には古典的経路（カノニカル経路）と非古典的経路（ノンカノニカル経路）の二種類があります。古典的経路では、カスパーゼ－1（caspase－1）の活性化が誘導され、これによりIL－1βおよびIL－18が活性化されます。

　マウスのカスパーゼ－11（caspase－11）や、それに対応するヒトのカスパーゼ－4（caspase－4）は、非古典的インフラマソームシグナル伝達経路を活性化します。これらのカスパーゼは細胞質内のリポ多糖（LPS）を認識し、ガスダーミンD（GSDMD）の活性化を引き起こして細胞のピロトーシス（細胞焦死）を誘発すると同時に、NLRP3インフラマソームを活性化し、IL－1βの放出を誘導します。この免疫応答は、宿主による病原体感染防御の重要なメカニズムとして機能します。しかし、カスパーゼ－11が具体的にどのようなメカニズムでNLRP3を活性化するかについては、まだ解明されていない点が多いです。

　このたび、中国北京大学医学部基礎医学研究院のXia Pengyan(夏朋延)教授らの研究チームは、中国科学院微生物研究所のWang Shuo(王碩)教授らと共同で、非古典的なNLRP3インフラマソームの活性化経路について詳しく解析を行いました。その結果、オーファン受容体Nur77が細胞内のLPSと認識し、非古典的な活性化経路を仲介することを明らかにしました。この研究成果は2023年3月30日に国際的な学術誌『Immunity』に掲載されました。

研究材料および方法

　非古典的なNLRP3インフラマソーム活性化経路を解明するため、研究チームはNr4a1－/－、Nlrp3－/－、Casp4－/－、Gsdmd－/－、Aim2－/－、Tlr4－/－といった複数の遺伝子ノックアウトマウス（すべてCyagen Biosciencesより提供）を用いました。これらのマウスから骨髄由来マクロファージ（BMDM）細胞を調製し、もしくは直接実験に使用しました。研究では、プルダウンアッセイ（pull－down assay）を用いて複数の成分間の相互作用を解析し、酵母ツーハイブリッド法および免疫沈降法（IP）を用いてNur77とNLRP3との結合を検証しました。

技術フロー

1. 質量分析により、Nur77が細胞内でLPSに結合するタンパク質であることが同定されました。
2. 一連の実験により、Nur77がNLRP3と結合することが確認されました。ただし、この結合にはLPSとdsDNAが共存する条件下でのみ生じることが示されました。
3. dsDNAの起源はミトコンドリアにあり、その生成にはGSDMDがミトコンドリア膜に孔を開けることが必要であることが分かりました。
4. Nur77は宿主内のエンドトキシン応答を顕著に増強することが明らかになりました。

研究結果

1. Nur77はLPSの細胞内受容体である

　細胞内でLPSと結合するタンパク質を同定するため、研究者らは骨髄由来のマクロファージ（iBMDM細胞）に対して質量分析を行いました。その結果、caspase－11以外にもLPSと結合すると推定されるタンパク質が9種類確認されました。その後、CRISPR－Pro技術を用いてこれらの遺伝子をノックアウトしたiBMDM細胞を作製し評価した結果、Casp11（caspase－11をコードする）およびNr4a1（核内受容体Nur77をコードする）の両方を欠失した細胞だけが、LPS刺激下でIL－1βを分泌できませんでした。この結果から、Nur77は非古典的なインフラマソームシグナル伝達経路に重要な役割を果たす可能性が示唆されました。

　さらに、Nr4a1－/－マウス（Cyagen Biosciences提供）から分離した原代BMDM細胞を用いて解析を行いました。LPSをトランスフェクションした際、Nr4a1－/－ BMDM細胞ではcaspase－1の活性化が認められなかったが、caspase－11やGSDMDの活性化には影響がありませんでした。また、Nr4a1－/－細胞ではIL－1β分泌が顕著に減少しましたが、細胞のピロトーシス（細胞焦死）には影響がありませんでした。これらの結果は、Nur77が非古典的なNLRP3インフラマソームの活性化に必須であることを示しています。

　研究者らは、Nur77が細胞内のLPSを直接検知する受容体であると推測しました。非変性ゲル電気泳動分析により、Nur77をLPSと共培養すると、Nur77単独の場合よりも移動速度が遅くなったことから、この2つの分子間に直接的な結合があることが示唆されました。また、生物素標識したLPSを用いたプルダウン分析により、組換えNur77タンパク質が沈殿されることが確認され、Nur77が細胞内LPS受容体であることがさらに裏付けられました。さらに、Nur77のC末端領域（特に524－547アミノ酸部位）がLPSとの結合に関与しており、この領域を欠失したNur77はLPSと結合できないことが明らかになりました。

2. Nur77はLPSとdsDNAの存在下でNLRP3インフラマソームを活性化する

　これらの結果に基づき、研究者らはNur77がcaspase－11およびGSDMDの下流に位置するNLRP3インフラマソームの活性化に関与すると仮説を提案しました。具体的な分子メカニズムを明らかにするため、酵母ツーハイブリッド法（yeast two-hybrid assay）を用いた解析を行い、Nur77（1－287アミノ酸断片）がNLRP3のLRRドメインと相互作用することを確認しました。またHEK293T細胞を用いた免疫共沈降実験により、Nur77（1－357アミノ酸）と全長のNLRP3の結合が確認された一方、全長Nur77と全長NLRP3の結合は観察されませんでした。

　一連の実験により、研究者らはNur77がNLRP3と結合するためには、LPSとNBREを含むdsDNAの同時存在が必要であることが明らかになりました（図1）。LPS刺激を受けたBMDM細胞を用いた免疫蛍光染色においても、Nur77とNLRP3が共局在することが確認されました。

図1　Nur77はLPSおよびdsDNAの存在下でNLRP3と結合する^［1］

　では、このdsDNAの起源はミトコンドリアであると考えられるのでしょうか。GSDMDがマクロファージ内でミトコンドリアDNAの放出を引き起こすかを検証するため、研究者らはBMDM細胞にLPSをトランスフェクションし、細胞内の各成分を分画して解析しました。その結果、切断されたGSDMDがミトコンドリア画分に存在し、細胞質中に放出されたミトコンドリア由来のdsDNAが増加していることが示されました。また、ミトコンドリアDNAを枯渇させた場合、BMDM細胞はLPS刺激後のNLRP3インフラマソームの活性化が低下しました。さらに、Nr4a1－/－ BMDM細胞においてミトコンドリアDNAの放出経路を阻害すると、非古典的NLRP3インフラマソームの活性化も抑制されました。これらの結果から、GSDMDがミトコンドリア膜に孔を形成し、ミトコンドリアDNAを細胞質へ放出することがNur77の活性化に不可欠であることが示唆されました。

　非古典的NLRP3インフラマソームの活性化におけるGSDMDの重要性を踏まえ、研究者らはNur77とNLRP3の関係性を明らかにするため、Gsdmd－/－ BMDM細胞を用いて実験を行いました。その結果、Gsdmd－/－細胞ではLPS刺激後、Nur77がNLRP3と結合せず、またNur77がミトコンドリアDNAと結合する様子も確認されませんでした。同様に、Casp11－/－ BMDM細胞においても、Nur77とNLRP3の結合は障害されていました（図2）。したがって、Nur77による非古典的NLRP3インフラマソームの活性化には、caspase－11によるGSDMDの切断が必要であると考えられます。また、DNA結合ドメインまたはLPS結合部位を欠失したNur77は、NLRP3の活性化を促進することができませんでした。

図2　Nur77によるNLRP3の活性化はcaspase－11およびGSDMDに依存する^［1］

3. Nur77の欠損は宿主のエンドトキシン応答を軽減する

　最後に、研究者らはNur77が敗血症における機能を解析しました。彼らは、poly(I:C)で前処理した後、LPSを注射する敗血症モデルを構築し、野生型マウス、Nr4a1－/－マウス、Nlrp3－/－マウス、Casp11－/－マウス（すべてCyagen Biosciencesより提供）を比較しました。その結果、Nr4a1－/－マウスでは血清中のIL－1β濃度が低下しており、この傾向はNlrp3－/－マウスと類似していました。腹腔マクロファージを分離して調べたところ、Nr4a1の欠損はピロトーシス（細胞焦死）の誘導には影響を与えませんでした。

　さらに、致死量のLPSを注射した際、Nr4a1－/－マウスは野生型マウスに比べて生存時間が延長されました。これらの結果から、Nur77は宿主におけるエンドトキシンに対する炎症反応を促進する要因であることが示唆されました。

研究結論

図3　Nur77がLPSと結合して非古典的NLRP3インフラマソームを活性化する模式図^［1］

　総じて、本研究は、Nur77が細胞内のLPSセンサーとして機能し、ミトコンドリアDNAおよびLPSと結合することで、非古典的NLRP3インフラマソーム経路を活性化することを明らかにしました（図3）。著者らは、Nur77がcaspase－11の活性化とその下流に位置するNLRP3インフラマソームの形成をつなぐ架け橋として働くことにより、炎症性疾患や敗血症の治療に向けた新たな治療標的となる可能性が示唆されました。

参考文献

• Zhu F, Ma J, Li W et al., The orphan receptor Nur77 binds cytoplasmic LPS to activate the non-canonical NLRP3 inflammasome. Immunity (2023)．

　　　https://doi.org/10.1016/j.immuni.2023.03.003

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