セリンを含む中程度のN2C GGCリピートが初めて早期パーキンソン病様の表現型を誘導することを確認
神経変性疾患の研究分野において、NOTCH2NLC（N2C）遺伝子内のGGCリピート配列の異常な伸長は近年注目を集めています。この異常リピート伸長は、神経核内封入体病（NIID）、パーキンソン病（PD）、前頭側頭型認知症（FTD）、および本態性振戦（ET）など、複数の神経変性疾患と関連していることが報告されています。一般的に、健康な人のGGCリピート数は30回以下ですが、60回を超えると病的とされ、130回以上のリピートを持つ患者も少なくありません。
特筆すべきは、一部のPD患者において、GGCリピート内にAGC（セリンをコード）挿入が認められる点です。中程度（41～64回）のGGCリピートを持つPD患者におけるAGC挿入の頻度は、NIID患者の約3倍にのぼり、AGC挿入およびリピートサイズがPDの発症に関与する可能性があると考えられています。さらに、近年の研究では、N2C-GGCリピート由来のポリグリシン（polyG）タンパク質が神経毒性を促進することが示されていますが、セリン挿入を伴う中程度リピートの機能的影響についてはこれまで不明でした。
こうした背景のもと、シンガポール国立神経科学研究所などの研究チームは、細胞モデルおよびマウスモデルを用いた解析により、セリンを含む中程度のGGCリピートが神経変性に与える病態生理的影響を世界で初めて明らかにしました。研究では、これらのリピート配列がミトコンドリア障害と過剰髄鞘形成（オーバーマイエリネーション）を誘導することが示され、これは早期パーキンソン病患者に見られる臨床的特徴と一致しています。本成果は、権威ある学術誌《Molecular Neurodegeneration》に掲載されました。
研究材料と方法
本研究では、研究チームはまずセリン挿入の有無とGGCリピートサイズの異なる細胞モデルを構築した上で、トランスジェニックマウスの作製をサイヤジェン株式会社（Cyagen）に依頼しました。Cyagenは、セリン挿入を伴う中程度のGGCリピートを正確に導入したモデルマウスを提供し、本研究の病態解析に不可欠なin vivo実験基盤を支えました。これらのモデルを用いて、全細胞パッチクランプ法による神経興奮性の評価、RNAシークエンシングとバイオインフォマティクス解析による脳内の遺伝子発現変化の解析、そして透過型電子顕微鏡による大脳皮質の髄鞘構造の詳細な観察が行われました。
技術的アプローチ
1．細胞モデルの構築
セリンを含む中程度GGCリピートが神経変性とミトコンドリア機能に与える影響を解析します。
2．トランスジェニックマウスの構築
セリンを含む中程度GGCリピートの病態形成メカニズムをin vivoで検証します。
3．トランスクリプトーム解析
32G13Sマウス大脳皮質の遺伝子発現プロファイルを解析した結果、ミトコンドリア関連経路および髄鞘構成要素の異常が確認されます。
4．免疫染色および透過型電子顕微鏡による検証
セリンを含む中程度のリピートが髄鞘の過形成を誘導していることを確認します。
研究結果
1．セリンを含む中程度のリピートがin vitroでタンパク質凝集を促進し、ミトコンドリア機能を障害
研究チームは、GGCリピートの長さとAGC（セリンをコード）挿入の有無が神経毒性に影響を及ぼす可能性があると考え、その作用メカニズムを解明すべく実験を行いました。研究に用いる各種N2C2フラグメントの合成および発現ベクターの構築は、Cyagenによって実施されました。構築されたベクターには、N2C2-13G（野生型）、45G、32G13S（中程度GGCリピート＋セリン挿入、セリン含有率28.8%、PD患者に近い配列）、89G、63G27S（病的リピート＋セリン含有率30%）が含まれます（図1）。
実験の結果、リピート長の増加に伴って可溶性N2Cタンパク質は減少し、不溶性N2C-polyGタンパク質の蓄積が増加しました。これは、病的なタンパク質凝集が進行していることを示しています。特に注目すべきは、45Gと比較して32G13Sでは顕著な細胞死が観察され、セリン挿入が中程度のリピートでも神経毒性を増幅する可能性がある点です。
また、5-アミノレブリン酸（5-ALA）およびその代謝産物プロトポルフィリンIX（PpIX）が、in vitroでのN2C-polyG凝集を効果的に抑制することも確認されました。
図1：セリン挿入を伴う中程度GGCリピートがタンパク質凝集を促進する
さらに、研究者らはセリン挿入を含むN2C中程度リピートがミトコンドリア機能を阻害する可能性についても検証しました。細胞の酸素消費率（OCR）を測定した結果、GGCリピート長の増加により基礎呼吸速度が低下し、さらにセリン挿入がこの呼吸機能を著しく損なうことが明らかになりました。加えて、ミトコンドリアATP産生量もリピート長の増加とともに減少し、セリン挿入によってその低下はさらに顕著になりました。
これらの結果は、セリン挿入を伴う中程度のGGCリピートがミトコンドリアのエネルギー産生機能を破綻させ、それが細胞死および神経変性の引き金となることを示唆しています。
2．セリンを含む中程度GGCリピートがマウスに初期パーキンソン病様の病態を誘導
AGC挿入を伴う中程度のN2C-polyGリピート拡張が引き起こす病理的影響をさらに明らかにするため、研究チームはCyagenに依頼し、N2C-polyGトランスジェニックマウスの複数系統を構築しました。構築されたモデルには、N2C-30G（低リピート）、45G（中リピート）、および32G13S（セリン挿入率28.9%の中リピート）が含まれます。
実験の結果、32G13Sマウスでは、30Gおよび45Gと比較して、フィブリル状のタンパク質凝集が顕著であり、パーキンソン病関連の主要タンパク質LRRK2の発現上昇、ミトコンドリア活性の低下、ならびにドパミン合成の律速酵素であるチロシン水酸化酵素（TH）の発現低下が確認されました。これらの変化は、in vitroで観察されたミトコンドリア機能障害とも一致しており、パーキンソン病の臨床的初期症状に類似しています。
さらに、32G13Sマウスにおいては、線条体および大脳皮質におけるTH陽性ドパミン神経の有意な減少が見られ、中脳にはフィブリル状のα-シヌクレイン凝集体も確認されました（図2）。このことから、ドパミン神経の脱落は主に大脳皮質および線条体で起こっており、中脳では限定的であることが示唆されます。これらの結果は、セリン挿入を伴う中程度GGCリピートが、タンパク質凝集とミトコンドリア障害に起因する神経毒性を加速させ、初期パーキンソン病様の表現型を引き起こすことを裏付けるものです。
図2：セリン挿入を含む中リピートによって、初期パーキンソン病様の表現型が観察される
電気生理学的解析（全細胞パッチクランプ法）により、32G13Sマウスの大脳皮質神経細胞において過剰な興奮性が誘導されていることが明らかになりました。加えて、12カ月齢の32G13Sマウスに対する行動試験においても運動障害が認められ、具体的には：
- ロタロッド試験では歩行持続時間の短縮
- シリンダー試験では立ち上がり行動の回数減少
といった特徴が確認されました。これらのデータは、セリンを含む中程度のGGCリピートが皮質神経の過興奮を誘導し、運動機能障害をもたらす可能性があることを示しています。
3．セリン挿入を伴う中程度GGCリピートがマウスにおける過剰髄鞘形成（オーバーマイエリネーション）を誘導
研究チームは、次に発症機構に関与する可能性のある分子経路を明らかにすることを目的とし、32G13Sおよび45Gマウスの大脳皮質における遺伝子発現を比較解析しました。その結果、32G13Sマウスではカルシウムシグナル伝達経路およびMAPKシグナル伝達経路の異常が認められました。これらの経路は、ミトコンドリア機能と密接に関係していることが知られています。
また、髄鞘構成に関連する遺伝子（MBP、MOGなど）の転写レベルは低下していた一方で、MBPおよびMPGタンパク質の発現は大きく上昇していました。この乖離は、ミトコンドリア障害による皮質神経細胞の損失に対し、神経伝達機能の維持を目的とした代償的な髄鞘形成が促進されている可能性を示唆しています。
髄鞘構成タンパク質の増加とオーバーマイエリネーションの確認
この仮説を検証するため、研究者らは12カ月齢のN2Cトランスジェニックマウスに対して免疫組織化学染色を実施しました。その結果、32G13Sマウスの大脳皮質ではMBPタンパク質の発現が顕著に増加しており、30Gおよび45Gと比較して、髄鞘分枝の増加、髄鞘の長さ・厚さの増大、髄鞘接続の増加といった過剰髄鞘形成の特徴的な形態変化が確認されました。
加えて、透過型電子顕微鏡による観察では、32G13Sマウスにおいてミトコンドリアの分枝が減少し、ミトコンドリアネットワークの破綻が生じていることが示されました。
これらの結果は、セリン挿入を含む中程度のGGCリピートが、ミトコンドリア機能障害に起因する過剰髄鞘化を引き起こすことを明確に示しています。
研究結論
図3 研究の示意図
本研究は、セリン挿入を含むN2C-polyG中程度GGCリピートがin vitroにおいて神経毒性を促進し、in vivoでは初期パーキンソン病に類似した病理生理的変化を引き起こすことを初めて示したものです（図3）。
さらに、この中程度リピートは、トランスジェニックマウスにおいてミトコンドリア機能障害、神経過興奮、過剰髄鞘化、および運動障害を誘導することが確認されました。
これらの知見は、初期パーキンソン病患者におけるN2C-polyG中程度リピートの臨床的意義の理解を深めるうえで重要な手がかりを提供するとともに、将来的な疾患バイオマーカーや治療標的の探索にも寄与することが期待されます。
参考文献
Tu H, Yeo XY, Zhang ZW, et al. NOTCH2NLC GGC intermediate repeat with serine induces hypermyelination and early Parkinson's disease-like phenotypes in mice. Mol Neurodegener. 2024 Nov 28;19(1):91.
