Molecular Cell｜山東大学齊魯病院などのチームがCDC6タンパク質の脱ユビキチン化メカニズムを解明

    細胞分裂周期タンパク質6（CDC6）は、DNA複製過程において重要な役割を果たします。前複製複合体（pre-RC）の核心メンバーとして、CDC6に変異または欠失が起こると、pre-RCの組み立てができず、DNA複製が抑制されます。CDC6は細胞周期の過程において重要な役割を果たしているため、その異常はさまざまな生理的および病理的な変化を引き起こす可能性があります。肺癌、結腸癌、乳癌などの多くの癌でCDC6の異常な上昇が観察され、予後不良と関連しています。

    そのため、CDC6の細胞周期における発現は厳密に調節される必要があります。しかし、細胞周期全体においてCDC6タンパク質のレベルとそのmRNAレベルの変動傾向は一致しないため、翻訳後調節がCDC6タンパク質レベルの制御に関与している可能性が示唆されています。CDC6は複数のE3ユビキチンリガーゼ複合体によってユビキチン化されますが、CDC6が去ユビキチン化酵素（DUB）によって直接的に調節されているかどうかは、現在のところ明らかではありません。

    山東大学齊魯病院の邹永新教授、史本康教授、山東大学微生物技術国家重点実験室の武大雷教授、および中国医学科学院腫瘍病院の邢念増教授が率いるチームは、去ユビキチン化酵素OTUD6AがCDC6の去ユビキチン化を媒介することを発見しました。OTUD6AはCDC6を上方調節することで細胞増殖と腫瘍発生を促進します。この研究成果は最近、『Molecular Cancer』誌に発表され、膀胱癌などの癌の診断と治療に新たなアプローチを提供しています。

研究材料と方法 

    この研究では、研究者たちはプロテオーム範囲でのDUBスクリーニングを通じて、CDC6の潜在的な調節因子を同定しました。OTUD6Aの機能を明確にするために、彼らは機能獲得および機能欠失実験を行いました。体外実験は複数の癌細胞株で実施され、体内実験では条件的Otud6a遺伝子ノックアウト（CKO）マウス（Cyagen Biosciences提供）を使用しました。また、N-ブチル-N-(4-ヒドロキシブチル)-ニトロソアミン（BBN）を用いて膀胱癌マウスモデルを誘導し、OTUD6A-CDC6軸の体内での作用を解析しました。

技術的な流れ

研究結果

1.OTUD6AはCDC6のタンパク質レベルを正向に調節する

    CDC6の潜在的な調節因子を系統的に同定するために、研究者たちはプロテオーム範囲でのDUBスクリーニングを実施しました。彼らは、去ユビキチン化酵素OTUD6AがCDC6のタンパク質レベルに最も強い上昇作用を持つことを発見しました。HEK293などの細胞でOTUD6Aを安定的に過剰発現させると、CDC6のタンパク質レベルが増加しましたが、そのmRNAレベルは増加しませんでした。逆に、shRNAを使用してOTUD6Aをノックダウンすると、CDC6のタンパク質レベルが有意に低下しましたが、mRNAレベルには影響を与えませんでした。

    OTUD6Aが体内でCDC6を調節する作用を証明するために、研究者たちはOtud6a^flox/floxマウス（Cyagen Biosciences提供）とDppa3-Creマウスを交配し、条件的なOtud6a遺伝子ノックアウト（CKO）マウスを作製しました。野生型マウスと比較して、CKOマウスは出生後18日目から成長曲線に顕著な差異が現れ、マウス胚線維芽細胞（MEF）の増殖は非常に遅く、CKOマウスのほとんどの組織はCDC6のタンパク質発現が低かったです。これらの結果は、OTUD6Aが体外および体内でCDC6のタンパク質レベルを正向に調節することを示しています。

    では、OTUD6AとCDC6は直接的に相互作用するのでしょうか？免疫蛍光染色の結果、OTUD6AとCDC6は細胞核および細胞質で共定位していることが示されました。免疫共沈降分析により、CDC6とOTUD6Aが全細胞裂解液中で相互共沈降することが確認され、OTUD6AのN端領域がその相互作用を媒介していることが示されました。さらに、二分子蛍光補完（BiFC）などの分析でも、両者の間に直接的な相互作用があることが確認されました。さらに重要なのは、この相互作用がS期後期に検出され、主にG2/M期で発生し、CDC6のタンパク質レベルの変動傾向と一致することです。

2.OTUD6AはCDC6上のポリユビキチン鎖を除去し、CDC6の安定性を維持する

    OTUD6Aが転写後レベルでCDC6の発現を調節することを考慮し、研究者たちはまずOTUD6AがCDC6タンパク質の安定性に与える影響を調査しました。OTUD6Aを過剰発現させた細胞では、CDC6タンパク質の半減期が延長され、OTUD6Aをノックダウンまたはノックアウトするとその半減期が短縮されました（図1）。これは、OTUD6AがCDC6の分解を抑制することを示しています。その後の研究で、プロテアソーム阻害剤MG132処理がOTUD6AノックダウンによるCDC6タンパク質レベルの低下を回復させることが確認され、OTUD6Aがユビキチン-プロテアソーム系を通じてCDC6タンパク質の安定性を調節している可能性が示唆されました。

    去ユビキチン化酵素は、ポリユビキチン鎖を除去することによって基質の安定性を維持します。体外での去ユビキチン化分析により、OTUD6AがCDC6上のポリユビキチン鎖を除去することが確認されました。逆に、OTUD6Aをノックダウンすると、CDC6のポリユビキチン化が増加しました（図1）。さらに、研究者たちは、OTUD6Aの去ユビキチン化酵素の死亡変異体（C152A変異体）がCDC6タンパク質の上昇作用を失い、内因性および外因性CDC6のポリユビキチン化を減少させないことを発見しました。その後の分析により、OTUD6AはCDC6上のK6、K33、K48結合のポリユビキチン鎖を除去することが明らかになりました。これらのデータは、OTUD6AがCDC6の安定性を維持し、APC/C-CDH1およびSCF-Cyclin Fによって引き起こされるCDC6の分解を逆転させることを示唆しています。

図1．OTUD6AはCDC6上のポリユビキチン鎖を除去し、CDC6の安定性を維持する^[1]

3.OTUD6A-CDC6軸は癌細胞の発癌性を促進する

    研究者たちは、OTUD6AがCDC6と同様に、細胞周期の調節において重要な役割を果たす可能性があると考えました。そこで、彼らはOTUD6Aが細胞周期過程においてどのように発現するかを分析しました。その結果、U2OS細胞におけるOTUD6Aタンパク質レベルは細胞周期に伴って変動し、G2/M期でピークを迎え、その後G1期とS期で減少することがわかりました。さらに、内因性のOTUD6Aタンパク質レベルはCDC6のレベルとほぼ一致していました。また、OTUD6Aの抑制やCDC6のノックダウンはG2/M期の遅延を引き起こし、CDC6を過剰発現させることでOTUD6Aのノックダウンによって引き起こされたG2/M期の遅延が軽減されることがわかりました。これらの結果は、OTUD6AがCDC6に依存した形で細胞周期の進行を調節していることを示唆しています。

    これらの結果に基づいて、研究者たちはOTUD6Aが癌遺伝子である可能性があるとさらに推測しました。彼らは、OTUD6Aが膀胱癌細胞株において尿路上皮細胞よりも高いレベルで発現していることを発見しました。CCK8、クローン形成、EdU取り込みなどの実験により、OTUD6Aのノックダウンが癌細胞の増殖を抑制し、過剰発現が癌細胞の増殖を促進することが確認されました（図2）。腫瘍異種移植マウスモデルでも、癌細胞におけるOTUD6Aのノックダウンが腫瘍の成長を顕著に抑制することが示されました。同時に、体外および体内でCDC6の異所性発現がOTUD6Aのノックダウンによる癌細胞の増殖と腫瘍の成長抑制を効果的に逆転させることが確認されました。これらの結果は、OTUD6AがCDC6を上方調節することによってヒト癌細胞の発癌性を促進することを示しています。

    さらに、研究者たちはBBN誘導による膀胱癌マウスモデルを使用しました。これは膀胱腫瘍の発生メカニズムを探索するための一般的な方法です。IHC染色により、BBN処理時間の延長に伴ってOTUD6A、CDC6、およびKi-67タンパク質レベルが上昇することが示され、OTUD6AとCDC6が膀胱腫瘍の発生に関与している可能性が示唆されました。注目すべきは、OTUD6AのノックアウトがBBN処理後の膀胱腫瘍の発生を減少させ、悪性度を低下させ、CDC6タンパク質レベルを減少させることです（図2）。これは、OTUD6Aのノックアウトが化学的発癌物質による膀胱腫瘍の発生とCDC6タンパク質の発現を抑制できることを示しています。

図2．OTUD6A-CDC6軸は腫瘍の成長を促進する^[1]

    DNA損傷応答（DDR）の強化は、細胞の化学療法耐性の重要なメカニズムの1つと考えられています。CDC6はDDRの活性化を促進する重要な因子であると考えられています。OTUD6AがCDC6タンパク質を安定化させることを考慮して、研究者たちはOTUD6AがDDRおよび化学療法応答においても役割を果たすかどうかを分析しました。

    体外および体内の分析を通じて、OTUD6Aの抑制が腫瘍細胞の化学療法感受性を高めること、またOTUD6Aのノックダウンまたはノックアウトが腫瘍細胞のDNA損傷を増加させることが明らかになりました。さらに分析した結果、OTUD6AはCDC6-ATR-Chk1シグナル経路の活性を促進し、腫瘍細胞に化学療法耐性を与えることがわかりました。

4.高レベルのOTUD6AおよびCDC6は癌の予後不良と関連している

    最後に、研究者たちはOTUD6AによるCDC6の上昇が臨床的に重要であるかどうかを分析しました。彼らは20例の人間の膀胱癌組織と癌周囲の正常組織におけるOTUD6AおよびCDC6の発現レベルを検査しました。膀胱癌組織では、OTUD6AおよびCDC6のタンパク質およびmRNAレベルが対応する正常膀胱組織よりも高く、CDC6タンパク質レベルはOTUD6Aタンパク質レベルと正の相関を示しました。

    さらに、膀胱癌患者においてOTUD6AまたはCDC6のレベルが比較的高い場合、全生存期間（OS）が悪いことが観察されました。特に、OTUD6AとCDC6の両方が高レベルであることが膀胱癌患者の予後不良とより強い関連を示し、OTUD6Aが高くCDC6が低い患者は、OTUD6Aが低くCDC6が高い患者よりも良好な予後を示しました。これらのデータは、OTUD6A-CDC6軸が膀胱癌で優先的に活性化され、そのレベルが患者の生存期間の悪化と関連していることを示しています。したがって、OTUD6AおよびCDC6は膀胱癌患者の予後マーカーとして使用できる可能性があると考えられます。

研究結論

図3．OTUD6A-CDC6軸による細胞増殖およびDNA損傷応答機構の模式図^[1]

    総じて、この研究はOTUD6AがCDC6の新たな正の調節因子であることを発見し、細胞周期、細胞増殖、体の成長、腫瘍発生、DNA損傷応答、化学療法感受性において重要な役割を果たすことを示しました（図3）。これにより、OTUD6Aの生理的および病理的な機能についての理解が深まります。これらのデータは、OTUD6A-CDC6軸が癌治療の臨床ターゲットとして期待されることを示唆しています。

参考文献

• Cui, J., Liu, X., Shang, Q. et al. Deubiquitination of CDC6 by OTUD6A promotes tumour progression and chemoresistance. Mol Cancer 23, 86 (2024).

         https://doi.org/10.1186/s12943-024-01996-y

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